Genes 2021, 12, 1704. https://doi.org/10.3390/genes12111704  www.mdpi.com/journal/genes 
Review 
Epigenetic Mechanisms of ART‐Related Imprinting Disorders: 
Lessons from iPSC and Mouse Models 
Alex Horánszky 1,2, Jessica L. Becker 3, Melinda Zana 1, Anne C. Ferguson‐Smith 3 and András Dinnyés 1,2,4,5,* 
1  BioTalentum Ltd., 2100 Gödöllő, Hungary; alex.horanszky@biotalentum.hu (A.H.);   
melinda.zana@biotalentum.hu (M.Z.) 
2  Department of Physiology and Animal Health, Institute of Physiology and Animal Health,   
Hungarian University of Agriculture and Life Sciences, 2100 Gödöllő, Hungary 
3  Department of Genetics, University of Cambridge, Cambridge CB2 3EH, UK; jlb208@cam.ac.uk (J.L.B.); 
afsmith@gen.cam.ac.uk (A.C.F.‐S.) 
4  HCEMM‐USZ Stem Cell Research Group, Hungarian Centre of Excellence for Molecular Medicine,   
6723 Szeged, Hungary 
5  Department of Cell Biology and Molecular Medicine, University of Szeged, 6720 Szeged, Hungary 
*  Correspondence: andras.dinnyes@biotalentum.hu; Tel.: +36‐20‐510‐9632; Fax: +36‐28‐526‐151 
Abstract: The rising frequency of ART‐conceived births is accompanied by the need for an improved 
understanding  of  the  implications  of ART  on  gametes  and  embryos.  Increasing  evidence  from 
mouse models and human epidemiological data suggests that ART procedures may play a role in 
the pathophysiology of certain  imprinting disorders  (IDs),  including Beckwith‐Wiedemann  syn‐
drome, Silver‐Russell syndrome, Prader‐Willi syndrome, and Angelman syndrome. The underlying 
molecular basis of this association, however, requires further elucidation. In this review, we discuss 
the epigenetic and imprinting alterations of in vivo mouse models and human iPSC models of ART. 
Mouse models have demonstrated aberrant regulation of imprinted genes involved with ART‐re‐
lated IDs. In the past decade, iPSC technology has provided a platform for patient‐specific cellular 
models of culture‐associated perturbed imprinting. However, despite ongoing efforts, a deeper un‐
derstanding of  the susceptibility of  iPSCs  to epigenetic perturbation  is required  if  they are  to be 
reliably used  for modelling ART‐associated  IDs. Comparing  the patterns of susceptibility of  im‐
printed genes  in mouse models and IPSCs  in culture  improves  the current understanding of  the 
underlying mechanisms of ART‐linked IDs with implications for our understanding of the influence 
of environmental factors such as culture and hormone treatments on epigenetically important re‐
gions of the genome such as imprints.   
Keywords:  genomic  imprinting;  imprinting  disorders;  assisted  reproductive  technology;  DNA 
methylation; mouse models; iPSCs 
 
1. Background 
The epigenetic process of genomic imprinting regulates the expression of a subset of 
genes in a parent‐of‐origin specific manner. Through this mechanism, only the maternal 
or paternal allele of an imprinted gene is expressed, while the other allele is epigenetically 
repressed [1]. Cis‐acting regulatory elements called imprinting control regions (ICRs) con‐
fer imprinting on neighbouring genes. During male and female germline development, de 
novo methyltransferases methylate  ICRs  in a parental‐specific  fashion and  these marks 
withstand post‐fertilization epigenetic  reprogramming  to act as a memory of parental 
origin [2]. Hence imprinting is regulated by germline derived differential methylation that 
persists after fertilisation resulting in monoallelic gene expression and the correct dosage 
of imprinted gene products during development. Imprinted prenatal development and 
resource provisioning occur in the placenta and foetal growth, as well as in postnatal en‐
ergy  homeostasis,  brain  function,  and  behaviour  [3–5].  Therefore,  the  proper 
Citation: Horánszky, A.; Becker, J.L.; 
Zana, M.; Ferguson‐Smith A.C.;   
Dinnyés A. Epigenetic Mechanisms 
of ART‐related Imprinting   
Disorders: Lessons from iPSC and 
Mouse Models. Genes 2021, 12, 1704. 
https://doi.org/10.3390/genes 
12111704 
Academic Editor: Martine De Rycke 
Received: 13 October 2021 
Accepted: 25 October 2021 
Published: 26 October 2021 
Publisher’s Note: MDPI  stays  neu‐
tral  with  regard  to  jurisdictional 
claims in published maps and institu‐
tional affiliations. 
 
Copyright: © 2021 by the authors. Li‐
censee  MDPI,  Basel,  Switzerland. 
This article  is an open access article 
distributed under the terms and con‐
ditions of the Creative Commons At‐
tribution (CC BY) license (https://cre‐
ativecommons.org/licenses/by/4.0/). 
Genes 2021, 12, 1704  2  of  19  
 
establishment and maintenance of epigenetic control of the imprinted genes are pivotal to 
both the development of the conceptus and postnatal health. 
The influence of multiple imprinted genes has been further elucidated through stud‐
ies of patients exhibiting diseases now known as imprinting disorders (IDs). There are at 
least a dozen diseases that can be classified as IDs, and many share similar phenotypes 
which can make diagnosis difficult  [6]. Aberrant pre‐/postnatal development, hormone 
imbalances, learning and behavioural impairments, and/or poor feeding behaviour have 
been identified as common clinical features of patients with IDs. Furthermore, different 
IDs can involve the same imprinted locus depending on the parental origin of the molec‐
ular disruption. Copy number variation, uniparental disomy (UDP), epimutations, and 
genetic mutations are the four molecular defects that have been linked to IDs. The defects 
are not mutually exclusive, as a genetic mutation at a modifier locus may lead to epimu‐
tations elsewhere.   
In recent years, an increasing number of reports have suggested a relationship be‐
tween assisted reproductive technology (ART) and IDs. Multiple studies examining dif‐
ferent cohorts have noted an  increased rate of Beckwith‐Wiedemann syndrome  (BWS), 
Angelman syndrome (AS), Prader‐Willi syndrome (PWS), and Silver‐Russell syndrome 
(SRS)  in ART populations [7–12]. While  it is plausible  that ART may  interfere with the 
establishment and/or maintenance of imprints, the data are not comprehensive enough to 
draw definitive conclusions. Much of the patient data are incomplete and lack molecular 
characterisations of the diagnoses. Additionally, factors such as infertility, maternal age, 
and specific ART methods are often not  included  in  the analyses. Nevertheless, as  the 
frequency of ART‐facilitated births proceeds to increase, so does the importance of under‐
standing the effects of ART on gametes and embryos. 
2. Imprinting Disorders Associated with ART 
Understanding the molecular bases underlying the ID in ART patients may reveal 
patterns of vulnerability associated with ART procedures. Because no single molecular 
aberration defines an ID, if ART populations show enrichment for a particular defect, we 
may be able to determine modes of susceptibility. This can help improve ART technolo‐
gies while also expanding our understanding of imprinting and the susceptibility of im‐
prints to environmental influence more generally. 
2.1. Beckwith‐Wiedemann Syndrome 
BWS is classified as an overgrowth disorder and predisposes the individual to can‐
cerous and noncancerous tumour growth. The molecular changes most associated with 
BWS affect  the chromosome 11p15.5–11p15.4 region which  includes  two closely  linked 
clusters of imprinted genes and two ICRs. The paternally expressed insulin‐like growth 
factor  2‐encoding  gene  (IGF2)  and  the  maternally  expressed  long  non‐coding  RNA 
(lncRNA) H19 are controlled by the H19/IGF2:IG‐DMR, while the maternally expressed 
cell cycle inhibitor gene CDKN1C, neighbouring imprinted genes, and the paternally ex‐
pressed lncRNA KCNQ1OT1 are controlled by the KCNQ1OT1:TSS‐DMR. Epimutations 
are  the most common molecular defect seen  in BWS, as 50% of patients exhibit  loss of 
methylation (LOM) at the maternal KCNQ1OT1:TSS‐DMR and 5–10% show gain of meth‐
ylation (GOM) at the maternal IGF2/H19 DMR [13]. However, UPD, CDKN1C mutations, 
and general chromosomal abnormalities have also been detected [14]. 
The prevalence of BWS in naturally conceived children is estimated to range from 1 
in 13,700 to 1 in 287,000 live births [15]. Conversely in ART populations it has been demon‐
strated to be as high as 1 in 1126 live births in one USA‐based study [16], although varying 
results have been described  in other countries, with some reporting no association be‐
tween ART and BWS [17]. 
In a study using BWS patients from the Spanish Overgrowth Syndrome Registry [18], 
51% of spontaneously conceived individuals with BWS (71/139) exhibited epimutations, 
with  13%  showing UPD,  11% with CDK1NC mutations,  and  6.5% with  chromosomal 
Genes 2021, 12, 1704  3  of  19  
 
rearrangements. Comparatively, 88% of the ART cohort (15/17) showed KCNQ1OT1:TSS‐
DMR hypomethylation. However, the ART cohort only accounted for 9% of the total pop‐
ulation assessed (17/187). Another study found no significant differences in the frequency 
of KCNQ1OT1:TSS‐DMR hypomethylation among the ART (15/16) and non‐ART (21/24) 
BWS cohorts [19]. Meta‐analyses suggest an overrepresentation of KCNQ1OT1:TSS‐DMR 
LOM in ART populations, though all the included studies remain hindered by low sample 
sizes [18].   
2.2. Silver‐Russell Syndrome 
SRS is associated with intrauterine growth restriction, low birth weight, slow post‐
natal growth, and body asymmetry. Diagnosis of SRS is therefore particularly difficult, as 
many clinical features of the disease are non‐specific and the underlying molecular cause 
can only be identified in 60% of patients [20]. The most common mechanism, reported in 
30–60% of patients, is LOM at the H19/IGF2:IG‐DMR in the 11p15.5 region [21]. Alterna‐
tively, the maternal UPD of chromosome 7 is seen in 5–10% of the SRS population, how‐
ever there is no consistent pattern in which the chromosome 7 imprinted genes are dis‐
rupted in SRS patients [22]. MEST and GRB10 are known imprinted genes found on chro‐
mosome 7, yet sequencing and methylation studies of patients suggest that these genes 
are not perturbed in SRS. 
The incidence of SRS in the naturally conceived population is estimated to range from 
1 in 30,000 to 1 in 100,000 [21], however the literature is lacking in reliable estimates re‐
garding SRS  incidence  in ART populations. Two epidemiological studies  in  Japan con‐
ducted in 2009 and 2015 found that all ART‐SRS patients sampled had DNA methylation 
errors, while  the non‐ART cohort demonstrated  the expected distribution of UPD and 
methylation errors [23,24]. SRS was the ID with the highest frequency in the 2015 survey, 
with the number of ART‐SRS patients 8.91‐fold higher than expected (8/67). However, as 
with the BWS studies, the ART cohort sizes are significantly smaller than those of the non‐
ART. Furthermore, no novel imprinting errors were found within the ART‐SRS popula‐
tion. Given the currently available patient data and general lack of understanding of SRS, 
one cannot assert a strong correlation between ART and this ID.   
2.3. Prader‐Willi Syndrome 
Individuals  with  PWS  exhibit  a  broad  range  of  symptoms,  including  restricted 
growth,  learning difficulties, and hypotonia. Both  the genomic and epigenetic changes 
that cause PWS affect the paternally expressed genes on chromosome 15q11.2‐q13. Micro‐
deletion of the paternal copy of chromosome 15 accounts for the underlying defect in 65–
75% of the PWS population, with maternal UDP seen in 20–30% and epimutations found 
in< 5% of patients [25]. The affected imprinted genes are MKRN3, MAGEL2, NECDIN, and 
SNURF‐SNRPN, as well as six small nucleolar RNAs (snoRNAs).   
The relationship between PWS and ART is the subject of debate, with recent studies 
offering contradicting conclusions. The prevalence of PWS in naturally conceived children 
is approximately 1 in 10,000 to 1 in 30,000 live births [15]. Analyses of Danish, Finnish, 
and American PWS cohorts did not find a significant increase in the rate of PWS among 
ART populations [7,26]. Another study reported a 1.5% incidence of PWS in ART patients 
(4/261), although this increase is not significant compared to naturally conceived children 
[27]. In contrast, the 2015 epidemiological study from Japan noted an association between 
ART and PWS  [24]. Potential differences  in regional methodologies and  the numerous 
limitations to ART population studies can explain the conflicting results. However, even 
the studies that do not show an overall increase in PWS offer important insights to IDs in 
ART groups. Gold and colleagues  found an  increase  in  the  rate of maternal UDP and 
methylation errors in PWS‐ART patients [26]. Unfortunately, these two populations were 
grouped together and the source data did not distinguish the two mechanisms. Maternal 
age has been previously implicated in increased maternal UDP in PWS patients [28]. As 
advanced maternal  age  is  enriched  in ART  populations, we  cannot  determine  if  this 
Genes 2021, 12, 1704  4  of  19  
 
association is a result of the ART procedures or age of the mother. Nevertheless, the study 
shows that even if ART does not influence the frequency of IDs, it may cause novel epige‐
netic errors that  lead to IDs. Detailed characterizations of  the epigenomes of ART‐con‐
ceived  individuals, especially  those with  IDs, will  improve our understanding of how 
ART procedures affect DNA modifications. 
2.4. Angelman Syndrome 
Characteristics of AS, which affects approximately 1 in 15,000 people [15], are devel‐
opmental delays, intellectual disability, speech impairment, and ataxia. The molecular ba‐
sis of AS is well‐characterised as all defects affect the UBE3A gene on 15q11.2‐q13, which 
is maternally expressed in the developing brain. The distribution of molecular defects of 
AS is like that of PWS, with many cases (65–75%) resulting from microdeletions on the 
maternal chromosome [29]. Unlike the previously mentioned IDs, recent studies have ne‐
gated  the association between AS and ART, with no significant  increase  in prevalence 
compared to naturally conceived births, and no novel molecular disruption is found in 
AS‐ART patients [7,24,30]. However, models of AS may prove to be a useful tool in un‐
derstanding the mechanisms of  imprinting, given the clearly defined temporal, spatial, 
and chromosomal impacts of the disease. 
3. A Need for Improved Imprinting Model Systems 
The effects that ART procedures exert on the gamete and embryo have been the sub‐
ject of many investigations in recent times using experimental systems. These procedures 
occur during developmental windows associated with a critical temporally coordinated 
period of epigenetic reprogramming that is vulnerable to epigenetic aberrations [31]. The 
potential to comprehensively assess ART‐induced effects on DNA methylation and im‐
printing is limited by the heterogenous nature of fertility treatments, differences between 
imprinted regions, and  the various  tissues and  techniques used  for measurements [32]. 
Larger and more well‐defined cohorts and a standardization of measurement techniques 
are required to overcome these complications. Mouse models of ART overcome many of 
the issues presented in the epidemiological human studies, while stem cells hold increas‐
ing promise for modelling imprinting disorders associated with ART. 
ART procedures can include manipulations of different stages of the conception pro‐
cess, such as stimulating gamete generation and ex vivo embryonic cultures. Several pro‐
cesses  involved  in ART can potentially perturb normal genomic  imprinting. Such pro‐
cesses include in vitro oocyte maturation, direct injection of sperm in ICSI, transferring in 
vitro cultured preimplantation embryos to the uterus, cryo‐storage of embryos and gam‐
etes, and hormone induced downregulation of pituitary functions for superovulation [31]. 
Here, we review the epigenetic alterations and imprinting status in mouse models of ART 
and of iPSCs in culture, assessing their strengths and weaknesses as models for genomic 
imprinting and  imprinting disorders  associated with ART procedures. Combining  the 
knowledge obtained from these models and comparing patterns of vulnerability in im‐
printed loci can allow an improved understanding of the underlying mechanisms of im‐
printing disorders associated with ART, which can  in  turn  lead  to  the development of 
potential therapies and preventative measures.   
4. Mouse Models for Imprinting and ART 
Mouse models are an essential tool for the study of genomic imprinting and there is 
strong conservation of  the mechanisms underlying  imprinting  in mouse and man  [33]. 
The ICRs, genes, and epigenetic modifications that regulate gene expression in a parent‐
of‐origin manner are mostly conserved between humans and mice. The functions of sev‐
eral imprinted genes, the regulation of key imprinted clusters, such Cdkn1c/Kcnq1ot1 and 
Igf2/H19, and the effects of aberrant imprinting on gene function have been initially char‐
acterized  in mice [33–36]. Animal models are also advantageous for  investigations  into 
Genes 2021, 12, 1704  5  of  19  
 
the underlying mechanisms of IDs. Mouse models of several IDs, including those associ‐
ated with ART, have been developed, including BWS, SRS, PWS, AS and KOS, and Tem‐
ple syndromes [37–41].   
While it is currently unclear which aspects of ART procedures may perturb imprint‐
ing in human populations, advancements have been made in mouse studies. Numerous 
groups have reported DNA methylation errors at imprints in oocytes, placentas, and em‐
bryos after superovulation procedures in mice [42–48]. One study even found that super‐
ovulation altered H19 expression and Grb10 methylation more severely than IVF or in vitro 
maturation [45]. The mouse models recapitulate human studies, which show that methyl‐
ation of H19, PEG1, and KCNQ1OT1 is also altered in human oocytes after superovulation 
[49–51]. The expression of ZFP57, a key regulator of mouse imprints post‐fertilisation, is 
significantly reduced after superovulation in mouse oocytes [47]. However, in contrast to 
the mouse, ZNF57 is not detected in human oocytes; instead, ZNF445 is believed to confer 
the earliest methylation maintenance role at imprints post‐fertilisation [52,53]. Nonethe‐
less, the mouse studies suggest that superovulation has the potential to influence the ex‐
pression  of  oocyte  factors  that  regulate  post‐fertilisation methylation  imprints, which 
could contribute to epimutation and lead to IDs.   
Other  components of ART procedures have been  examined  individually  in mice. 
Cryopreservation of mouse embryos has been shown to affect methylation at KvDMR1 
[54]. Another study  found  that  the blastocysts and morulae of mice conceived via  IVF 
displayed abnormal DNA methylation at  the  Igf2/H19  imprinted  locus  [55]. Numerous 
other  factors, such as culture media and  the selection of  fast‐growing or slow‐growing 
cultured embryos for implantation, have been shown to have epigenetic consequences at 
the  imprinted  loci  [48,56].  The  culture  of mouse  embryos  has  been  demonstrated  to 
dysregulate imprints, with LOI detected at the maternally imprinted Peg3 and Snrpn, and 
the paternally imprinted H19, although in the literature there seems to be no difference 
between  the  frequency of LOI  in maternally and paternally methylated DMRs  [57–59]. 
There are several postulated mechanisms  for  the aberrant  imprinting displayed  in cul‐
tured embryos, such as changes in the expression and subcellular localization of DNMTs 
that are critical for imprint maintenance [9].   
Mouse studies have also been able to tease apart certain biases within human ART 
populations, including maternal age. While maternal age may influence chromosomal de‐
fects such as UPD, several studies have shown that it does not affect the methylation of 
imprints [60,61]. Table 1 summarizes many of the key findings of mouse studies of ART 
and imprinting. 
Table 1. DNA methylation and expression alterations of the imprinted genes implicated in IDs after ART procedures in 
mice. 
Procedure  Imprinted 
gene  Reported alteration 
ID associated with 
imprinted region   References 
Ex vivo em‐
bryo culture   H19 
 
LOM and biallelic expression   
 
LOM at ICR 
 
 
SRS   
  
 
[62,63]   
 
 
[56,64] 
 
 
IVF  
 
 
 
H19 
 
 
Aberrant imprint methylation result‐
ing in biallelic expression rather than 
expression solely from maternal al‐
lele.   
Aberrant methylation patterns at ICR 
 
 
 
 
SRS 
 
 
 
 
[55] 
 
[65] 
 
Genes 2021, 12, 1704  6  of  19  
 
 
 
 
 
 
H19  
LOM at ICR 
 
 
 
 
GOM at maternal ICR 
 
 
 
 
 
BWS  
 
[64] 
 
 
 
[55]  
 
 
Vitrification 
 
 
  
Grb10 
 
 
 
 
KvDMR1 
Reduced expression accompanied by 
downregulation of methylation. Re‐
duced methylation does not explain 
altered expression. 
 
GOM in fetuses compared to in vitro 
culture samples 
 
SRS 
 
 
 
 
BWS  
 
 
[66] 
 
 
 
[54] 
ICSI 
Snrpn 
 
 
Peg3 
 
 
H19 
LOM at maternal DMR and aberrant 
expression 
 
LOM at maternal DMR and aberrant 
expression 
 
LOM at ICR 
PWS 
 
 
/ 
 
 
SRS 
[67] 
 
 
 
 
[64] 
 
 
Superovula‐
tion  
 
 
 
H19 
 
 
 
 
Snrpn 
 
 
Kcnq1ot1 
 
 
Gbr10 
  
 
Aberrant expression   
 
Increased expression 
LOM at paternal allele 
 
 
LOM at maternal ICR 
 
LOM at DMR 
 
LOM at maternal ICR 
 
 
GOM at CGI1 and decreased expres‐
sion   
 
 
SRS 
 
 
 
 
PWS 
 
 
BWS 
 
 
 
SRS 
[65] 
 
[45] 
 
[44] 
 
 
[44] 
 
[68] 
 
[44] 
 
 
[45] 
In vitro folli‐
cle culture 
 
H19 
 
Snrpn 
 
Mest 
LOM at DMR 
 
LOM at DMR 
 
LOM at DMR 
SRS 
 
PWS 
 
SRS 
[68] 
 
[68] 
 
[68] 
Although mouse models have provided advancements in knowledge of genomic im‐
printing, there are limitations to modelling human imprinting defects in mice. For exam‐
ple, a causative factor of BWS, paternal UPD11, cannot be properly modelled using mice 
because uniparental disomy of mouse chromosome 7 causes embryonic lethality [69,70]. 
Moreover, paternal UPD11 patients display mosaicism, which has not been observed in 
mice [34]. Even subtle divergences in genetic and epigenetic regulation between mice and 
humans justify the need for human models of genomic imprinting. 
Genes 2021, 12, 1704  7  of  19  
 
5. iPSCs as a Tool to model Imprinting Disorders 
Due  to  the  limitations presented by  traditional mouse models, other strategies  in‐
volving  iPSCs can be utilized  to study  imprinting disorders and  the effects of ART on 
imprinted gene regulation. The advantages of using iPSCs derived from individuals with 
IDs include the preservation of genotype associated with imprinting disorders, while their 
use eradicates the need to induce genetic mutations that could otherwise lead to off‐target 
effects. Imprinting disorders can have complex and diverse aetiologies and therefore ex‐
tensive engineering is required to generate the full representation of the associated genetic 
and epigenetic effects. ID‐derived iPSCs offer a promising alternative as lineage‐specific 
differentiation of iPSCs can also be used to further investigate the effects of imprinting 
disorders in various tissues that would be difficult to obtain from human patients. Com‐
bining knowledge derived from iPSCs and mouse models can enable further insight into 
the genetic/epigenetic mechanisms involved in ART‐related imprinting disorders. 
Stem cells have the exceptional capabilities of proliferation, self‐renewal, and differ‐
entiation [71]. When given the correct conditions, self‐renewing stem cells have the capac‐
ity to differentiate into virtually any cellular lineage, and are therefore an invaluable re‐
source for disease modelling, the study of early human embryogenesis, and regenerative 
therapies [72]. The generation of iPSCs via the ectopic expression of reprogramming fac‐
tors in adult somatic cells was ground‐breaking and enabled the production of patient‐
specific, autologous iPSCs that pose no risk of immune rejection in cell‐based therapies 
[73–75]. iPSCs share common features with ESCs, including development potential, pro‐
liferation capacity, morphology, and similar gene expression and epigenetic patterns [76–
78].   
The use of iPSCs is increasingly appealing for modelling conditions that involve in‐
tricate genetic abnormalities, including imprinting disorders. Epigenetic status is erased 
and reset during iPSC reprogramming and imprinted gene expression relies upon the suc‐
cessful maintenance of epigenetic signatures. Thus, a thorough analysis of allele‐specific 
gene  expression and  imprinting  status  is  critical when modelling disorders associated 
with genomic imprinting, to ensure that the disease‐related epigenetic modifications are 
preserved in the obtained iPSCs. The successful production of iPSCs from patients with 
imprinting disorders such as AS and PWS was previously reported [79,80]. In one of these 
studies [79], Martins‐Tyler and colleagues derived iPSCs from a PWS patient with a small, 
atypical deletion spanning the SNORD116 cluster and IPW ncRNAs. It was shown that 
UBE3A displayed monoallelic expression and the lncRNA UBE3A‐ATS was expressed in 
the obtained iPSCs. Assessment of the PWS‐IC in obtained PWS iPSCs demonstrated, in 
all iPSC lines bar one, similar methylation levels compared to the fibroblasts used for re‐
programming, including a methylated maternal allele, and an unmethylated paternal al‐
lele. The iPSC line with an aberrantly methylated PWS IC was not used for further study.   
Yang and colleagues derived iPSCs from the fibroblasts of a diagnosed PWS patient 
with a balanced translocation of the 15q11‐q13 region to chromosome 4 [80]. They were 
deemed suitable  to model PWS  in vitro as they maintained characteristics synonymous 
with the disease, including high DNA methylation levels in the maternal PWS IC and a 
diminished expression of PWS‐associated  imprinted genes. These  iPSCs were also suc‐
cessfully differentiated  into neuronal‐like  cultures.  It was not, however, determined  if 
other functionally relevant genetic or epigenetic aberrations were present in the cultures. 
Nonetheless, this study emphasizes the usefulness of iPSCs to enhance the understanding 
of imprinting‐related disorders, such as PWS.   
Similarly, the generation of AS iPSCs also confirmed the value of such cells to model 
the disease [81]. Of the three AS iPSC lines used, two contained a large deletion at 15q11‐
q13, while the third harboured a 2‐base pair deletion in UBE3A. Differentiated neuronal 
cultures from control iPSCs established the expected imprinted expression of UBE3A with 
virtually no UBE3A expression  in  the AS‐derived cells. Importantly,  this study did not 
determine the status of the methylation imprint at UBE3A following reprogramming pro‐
cedures.   
Genes 2021, 12, 1704  8  of  19  
 
A landmark earlier study by Chamberlain and colleagues using AS and PWS patient 
derived  iPSCs—genetically  conferred  rather  than  caused  by  an  epimutation—utilized 
DNA methylation analysis, allele‐specific PCR, and RNA‐FISH and found that copy num‐
ber variations of the chromosome 15q11‐q13 region were maintained through the repro‐
gramming process. It was also observed that DNA methylation at the PWS IC was not 
altered during reprogramming  [82]. This  indicates  that although substantial epigenetic 
changes accompany iPSC generation, an  intact methylation state at an ICR  is faithfully 
maintained, at least for this imprinted locus. A limitation to this study was that the AS 
iPSC lines contained sizeable deletions on the maternal chromosomes that consequentially 
led to the loss of approximately 28 genes. This renders it challenging to identify the spe‐
cific functions of UBE3A in neuronal function and pathogenesis. 
In a complementary study, Stanurova and colleagues used iPSCs from an AS patient 
with a defined 3‐base pair deletion in UBE3A [83]. It was reported that, upon the neuronal 
differentiation of AS iPSCs, the expected imprinted paternal repression of UBE3A and an 
upregulation of UBE3A‐ATS were observed. The cellular models in this study, involving 
iPSC  differentiation  into AS  and  the  control mixed  neuronal  cultures, were  therefore 
demonstrated to successfully replicate the tissue‐specific imprinting of UBE3A, leading to 
reduced expression of UBE3A in the patient‐derived cells. Using deep bisulphite amplicon 
sequencing, it was reported that the differential DNA methylation at a DMR (PWS‐SRO) 
within the PWS IC was maintained through iPSC reprogramming; however, losses and 
gains of methylation were observed at other regulatory DMRs at the locus. These findings 
suggest that the appropriate methylation imprints may be vulnerable to iPSC derivation 
and/or iPSC culture. This might be relevant for conditions associated with ART.   
In general, however, in the studies using iPSCs derived from the AS and PWS pa‐
tients, iPSCs mostly maintained the methylation status of the PWS‐IC. Nonetheless, there 
have been conflicting reports  in which  the PWS‐IC exhibited hypomethylation  in both 
‘healthy’ and, importantly, in PWS patient‐derived iPSCs [84,85]. Okuno and colleagues 
observed a reversal of a hypermethylated state of the PWS IC  in some PWS  iPSC  lines 
derived from one patient [85]. This loss of hypermethylation offers promise for a thera‐
peutic strategy that might reverse the PWS‐associated methylation and suggests that pa‐
tient‐derived cells might be susceptible to drug or other treatments that might modulate 
the DMRs. However, there were clear limitations from this study to be considered, includ‐
ing the fact that cells were derived from only one PWS patient, so no comparison to other 
patient‐derived  iPSCs could be made. Furthermore, assessment of  the consequences of 
methylation reversal on transcription was not assessed.   
Recently, the first human cell‐based model for BWS was also produced using iPSCs 
derived  from a pUPD11 patient,  recapitulating  the expected  transcriptional and epige‐
netic features of the disease [86]. DNA methylation analysis of the iPSC lines revealed the 
proper maintenance of the expected methylation at pUPD11 regions. These iPSCs there‐
fore provide a means to elucidate the imprint regulation in BWS including after successful 
differentiation into hepatocytes. This study, from a patient with mosaicism, derived iPSCs 
from different fibroblast samples, enabling the use of a non‐pUPD11 iPSC line as an iso‐
genic control. It was also demonstrated that the BWS iPSC lines used displayed the proper 
parent‐of‐origin methylation status at IC1 and IC2, which were maintained through re‐
programming and in culture. It would be of interest for future studies to examine the ef‐
fects of somatic tissue reprogramming at the IC1 and IC2 DMRs from BWS patients har‐
bouring epimutations, such as a GOM at the maternal H19/IGF2:IG‐DMRDMR. It could 
then be determined if such epigenetic alterations are maintained or corrected during re‐
programming and will allow for a more comprehensive assessment of the suitability of 
iPSCs as models for this disorder. 
Based on current evidence, the methylated status of ICRs are mostly faithfully reca‐
pitulated from imprinting patient‐derived iPSCs, suggesting that the reprogramming pro‐
cedures  replicate  post‐fertilization maintenance  of DNA methylation,  rather  than  the 
germline epigenetic erasure. iPSCs represent a promising modelling strategy for IDs and 
Genes 2021, 12, 1704  9  of  19  
 
future studies can consolidate this by investigating whether the methylated status of ID 
patients with epimutations as a causative factor is accurately reproduced in patient‐de‐
rived iPSCs.   
The  combined  results  of  iPSC models of ART‐related  imprinting disorders  show 
promise and provide an example of the various investigations that are already possible 
using  imprinting  patient‐derived  iPSCs,  including  the  uncovering  of  phenotypic  and 
mechanistic characteristics underlying the disorders. Future studies can more deeply ex‐
amine the dynamics of imprinting‐related pathologies during tissue specific differentia‐
tion, such as  the neuronal differentiation of AS  iPSCs,  for  the development of efficient 
therapies. A current drawback of the use of iPSC models is a variability in the differenti‐
ation efficiency amongst  iPSC cell  lines  [82], which could hinder comparisons between 
studies.  Importantly, while much effort  is  required  to understand  the effects of  repro‐
gramming on the epigenetic landscape of iPSCs derived from patients with IDs if they are 
to be used for reliable modelling, surprisingly little is known about the stability or vulner‐
ability of normal and abnormal imprints during  the  iPSC rederivation process  in these 
patient‐derived cells. Such data could provide novel  insights  into  the properties of  the 
germline imprint during stem cell reprogramming in vitro, and during the dynamic epi‐
genetic events associated with preimplantation development in ART‐associated culture 
conditions.   
6. The Effects of Reprogramming on Methylation Status in Normal iPSCs   
To comprehensively assess the potential of iPSCs for modelling imprinting disorders, 
the effects that reprogramming procedures exert on the normal epigenome must be better 
understood. Studying the DNA methylation alterations that occur and that induce loss of 
imprinting (LOI) during iPSC reprogramming could offer valuable insight into the vul‐
nerabilities of imprinted loci in ART‐associated imprinting disorders. The epigenetic re‐
setting that occurs during in vitro reprogramming of iPSCs features global DNA demeth‐
ylation, which is also observed during the reprogramming events in the early embryo and 
germ line during mammalian development [87]. iPSCs have been reported to harbour ep‐
igenetic modifications  and genetic deletions due  to  reprogramming,  and genomic  im‐
printing is especially sensitive to reprogramming processes [88–92].   
A 2014 study demonstrated that  iPSC reprogramming with the classic reprogram‐
ming factors (Oct3/4, Klf4, c‐Myc, Sox2) resulted in the generation of iPSCs that displayed 
a deviating methylation profile compared to ESCs and retained a somatic cell ‘memory’ 
of methylation status [93], a phenomenon also observed in a recent study using BWS iP‐
SCs[86]. It has been previously shown that the degree of methylation changes in iPSCs 
compared to the donor somatic cell is dependent upon the reprogramming efficiency and 
there  are  ongoing  efforts  to  increase  the  efficiency  of  the  reprogramming  procedures 
[94,95]. 
During  reprogramming,  iPSC  DMRs  are  obtained  in  the  reprogrammed  iPSCs 
[96,97]. These DMRs are primarily associated with genes and CpG islands and seem to be 
representative both of the ‘memory’ of the somatic cell methylome and of iPSC‐specific 
DNA methylation signatures. Interestingly, independent iPSC lines have been found to 
harbour common iPSC‐specific DMRs, suggesting an inherent vulnerability of particular 
loci to the altered methylation obtained during reprogramming procedures. Indeed, ge‐
nomic imprinting is facilitated by the formation of DMRs at specific genomic loci in gam‐
etes [98]. Thus, focused investigations into the susceptibilities of DMRs to aberrant meth‐
ylation in iPSCs have the potential to unlock further insight into the increased risk of LOI 
associated with ART and imprinting disorders through the comparison of patterns of vul‐
nerability in reprogrammed iPSCs and LOI in ART patients.   
Several factors can influence the variability and status of DMRs in iPSCs, including 
the genetic background of donor cells [99], the culture conditions [96,100], the method of 
derivation [93], age of the donated somatic cells [101,102], and the passage number [103]. 
Given that many imprinted genes are dosage‐sensitive regulators of cell proliferation, cell 
Genes 2021, 12, 1704  10  of  19  
 
selection within the cultures is likely to contribute to DMR status in culture. Interestingly 
though, it has been demonstrated that the continued passaging of iPSCs can reduce the 
divergence of methylation patterns between  iPSCs  and hESCs  [104,105]; however,  ex‐
tended passaging can also result in selection favouring growth‐related changes and epi‐
genetic aberrations [106]. For example, the aberrant biallelic expression of the paternally 
expressed mitogenic IGF2 gene, is implicated in the phenotypic overgrowth typically pre‐
sented in BWS [34]. 
7. Imprinting Status of iPSCs   
hPSCs derived via reprogramming methods (iPSCs and ntES) are reportedly more 
vulnerable to LOI in comparison to hESCs, while some imprinted loci are more suscepti‐
ble  to  LOI  than  others  [91–93,107,108]. One  study  identified  hypermethylation  at  the 
Dlk1/Dio3‐imprinted  region  in mouse  iPSCs, which  led  to  the  improper  expression of 
genes situated within this imprinted locus in these cells, such as Gtl2 [109]. Therefore, it is 
suggested that the reprogramming process itself is implicated in the decreased stability of 
imprinting in reprogrammed cells. Conversely there have been demonstrations that LOI 
is a rare event in iPSCs [110]. 
Indeed, several reports that the dynamic addition of de novo methylation marks and 
their erasure during iPSC culture does not apply to imprinted loci suggests that imprints 
may  be  less  susceptible  to  perturbations  associated  with  reprogramming  in  culture   
[108,111–113]. This implies a distinctive means of regulation of imprinted loci in these cells 
and that may reflect the in vivo protection that imprints undergo in the periconcep‐tional 
period so that the epigenetic memory of parental origin is preserved. The imprinting sta‐
tus of iPSCs, whether it includes LOI or not, is reportedly maintained during prolonged 
periods  of  culture  [92,110],  and  interestingly  aberrant  imprinting  patterns  endure 
throughout differentiation into diverse cellular lineages, just like in vivo. The induction of 
LOI in iPSCs and maintenance of the imprinting status following lineage‐specific differ‐
entiation are functionally relevant when considering the use of iPSCs for cellular regener‐
ation therapies and some disease modelling.   
Although  there are  inconsistencies  in  the  literature,  findings  imply  that  imprinted 
DMRs  can  be  susceptible  to  iPSC  reprogramming procedures  although  their  status  is 
maintained during culture [114]. Since several imprinted genes are located within clusters 
modulated by a unifying germline DMR, an aberration/deletion to a single DMR resulting 
in LOI can result in loss of expression or biallelic expression of multiple genes in theses 
clusters [2,115]. It has been suggested that the LOI during reprogramming is mediated by 
Ten‐eleven translocation methylcytosine dioxygenase (TET) proteins, which are cata‐lysts 
in the oxidation of 5‐mC to 5‐hmC. During the production of iPSCs there is a signifi‐cant 
increase in 5‐hmC, similarly observed during in vivo reprogramming. This is proba‐bly 
due to higher expression of TET1 and TET2 proteins, the depletion of which leads to a 
lower efficiency of iPSC reprogramming, suggesting a prominent role for TETs in the pro‐
cess [116]. In [117], Bermejo‐Álvarez and colleagues proposed that TETs are responsible 
for LOI at the H19 locus during reprogramming, as is observed in hESCs; however, it is 
postulated  that there may be other, more complex events  influencing  the regulation of 
DNA methylation patterns during reprogramming [87]. 
Varying rates of LOI amongst different hPSCs are accompanied by biallelic expres‐
sion/repression in the affected imprinted domains. Evidence from several iPSC lines has 
demonstrated that there is a set of imprinted genes that frequently exhibit biallelic expres‐
sion, including IGF2, H19, PEG3, PEG10, MEG3, and MEST [84,91,93,107]. In a large‐scale 
analysis of LOI in various iPSC lines, Bar and colleagues [92] identified the most com‐mon 
imprinted  loci  to display LOI were,  in no particular order, MEG3/DLK1  (chr14q32.2), 
H19/IGF2:IG‐DMR  (chr11p15.5),  and  Zdbf2/GPR1  (chr2q33.3).  Interestingly,  these  im‐
printed regions are all under the control of a paternally methylated DMR, though the pa‐
ternal mark at Zdbf2 is likely a somatic DMR and is therefore less likely to be affected by 
ART procedures [118]. Currently, 23 DMRs have been identified in the germ line, and in 
Genes 2021, 12, 1704  11  of  19  
 
only  three of  these DMRs  is DNA methylation established on  the paternally  inherited 
chromosome; the rest are methylated in the maternal germline [119]. Previous research 
utilizing iPSCs suggests that imprinted genes under the regulation of paternally methyl‐
ated DMRs are at a higher vulnerability to LOI than those under the control of maternally 
methylated DMRs [92,120]. The observed elevated susceptibility of genes under the regu‐
lation of paternal DMRs to LOI is evident in iPSCs, which implies that paternally methyl‐
ated regions are more vulnerable to alterations during reprogramming procedures   
This vulnerability of various imprinted genes can potentially be explained by the re‐
sistance of the imprinted genes to methylation erasure during the pre‐implantation stages 
of development [120]. The DNA methylation status at the DMRs must be maintained in 
order to preserve the memory of parental origin and during early developmental stages; 
ZFP57 and ZNF445 are both modifiers that are essential for the maintenance of imprints 
during genome‐wide methylation erasure. 
Zygotic ZFP57 has been demonstrated  to be  crucial  for  the maintenance of DNA 
methylation at some imprinted regions during iPSC derivation, such as DLK1/DIO3 and 
SNRPN [121]. However, ZFP57 was not required for the maintenance of methylation im‐
prints of other regions such as PEG1 and PEG3, which is now probably explained by the 
recent discoveries of  the role of ZNF445  [52]. Aberrant expression of  these ZFPs could 
therefore  contribute  to  the  altered methylation  state  at  imprints  in  cultured  PSCs.  In 
mouse the expression of ZFP57 is associated with pluripotency, with high expression de‐
tected in oocytes and the early embryo, and a gradual decrease in expression as lineage‐
specific differentiation progresses. ZFP57 expression is then undetectable in somatic cells 
[122,123]. This could offer an explanation to the increased vulnerability of iPSCs to aber‐
rant imprinting compared to ESCs, as iPSCs are derived from somatic cells that have a 
lower protective capacity over their imprinted regions. It is also a possibility that faulty 
regulation of DNMTs and TET proteins in culture could result in alterations to the ZFP 
binding sites; demethylation of the ZFP57 binding motif will render it unrecognisable by 
ZFP57, meaning KAP1 and DNMTs will not be recruited for DNA methylation mainte‐
nance, or to replace lost methylation [124]. 
Altered expression of ZFPs could explain imprinting aberrations in iPSCs and may 
also play a role in the imprinting defects observed in ART patients that lead to increased 
incidence of imprinting disorders. Further investigations into the effects of various ART 
procedures on the regulation of ZFP57 and ZNF445 could uncover more information on 
the increase in imprinting disorders observed in ART patients. It could also be interesting 
for future studies to monitor ZFP regulation in stem cell cultures to determine if they con‐
tribute to the increased susceptibility of iPSCs to LOI. 
Alterations at imprinted loci in iPSCs are consistent with findings from studies in‐
vestigating the methylation profiles of the DMRs of imprinted genes in ART‐conceived 
children. Barbaret and colleagues [125] reported a significant decrease in the methylation 
levels at the H19/IGF2:IG‐DMR, and a significant increase in the methylation of the PEG3 
DMR in children conceived via ART procedures (IVF/ICSI) compared to naturally con‐
ceived children. Results from this study also suggests that MEG3 DMRs are vulnerable to 
ART. The biallelic expression MEG3 has also been frequently reported in iPSCs. 
Another  study  found  that  human  placental  DNA  methylation  levels  at  the 
H19/IGF2:IG‐DMR and kcnq1ot1 imprinted loci were reduced in IVF/ICSI, and a decrease 
in methylation level at H19/IGF2:IG‐DMR was observed in placentas after IVF compared 
to ICSI [126]. A limitation to these studies, however, was their inability to completely dis‐
tinguish the contributions of ART and parental infertility to the altered DMRs.   Consid‐
ering similar alterations are observed at imprinted loci in iPSC culture, future studies that 
unearth the mechanisms of LOI and methylation changes in iPSCs could provide further 
mechanistic information regarding the alterations observed at DMRs associated with im‐
printed genes, and further clarify the association between ART and IDs.   
8. Conclusions 
Genes 2021, 12, 1704  12  of  19  
 
Until  large cohort  studies using  thorough and standardized analysis methods are 
conducted on the ART population, model systems will remain the gold standard for un‐
derstanding how ART influences the epigenome. Mouse models, which have been used 
to pioneer the field of imprinting, will continue to be fundamental tools in demystifying 
the relationship between ART and IDs. However, due to deviations in genomic imprint 
regulation and preimplantation development between rodents and humans, human stud‐
ies are necessary for mechanistic studies into genomic imprinting and related disorders. 
The use of human stem cells bridges the gap between clinical data and animal models.   
Most current studies reporting the methylation of ICRs in ID patient‐derived iPSCs 
report an accurate recapitulation of methylated status compared to their somatic cells of 
origin. This suggests that patient‐derived iPSCs could be a good model for epimutation 
induced IDs.   
The altered methylation and LOI observed  in normal  iPSCs  following reprogram‐
ming mirror many of the same defects found in embryos after ART procedures. Under‐
standing the exact mechanisms by which imprinted gene regulation is lost in iPSCs can in 
turn clarify the epigenetic mechanisms underlying IDs and how they are affected during 
ART procedures. Culture conditions and cell handling can  then be better optimized  to 
reduce stress on vulnerable loci.   
The  first ART‐conceived human precedes  the discovery of genomic  imprinting  in 
mammals by several years. This is  just one example of how medical technologies often 
outpace our basic understanding of biological processes. Furthermore, this underscores 
the importance of continuously reassessing and improving existing methods. Increased 
safety  and  reduced  epigenetic  abnormalities  from  ART  procedures  can  be  achieved 
through the knowledge gained from animal and stem cell‐based studies, which can ulti‐
mately lead to better health outcomes for ART patients. 
Author Contributions: Conceptualization, A.H and J.L.B; writing—original draft preparation, A.H 
and J.L.B; writing—review and editing, A.H, J.L.B, M.L. A.C.F.S and A.D; supervision, M.Z, A.C.F.S 
and A.D. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript. 
Funding: This review has received funding from the European Union’s Horizon 2020 research and 
innovation program under  the Marie  Skłodowska‐Curie grant  agreement No  812660  (DohART‐
NET) and Grant Agreement No. 739593 (HCEMM) (for A.D). 
Institutional Review Board Statement: Not applicable.   
Informed Consent Statement: Not applicable. 
Data Availability Statement: Not applicable.   
Conflicts of Interest: AH, MZ and AD are employed by BioTalentum Ltd and all authors declare 
no conflict of interest. 
Abbreviations 
ART—Assisted reproductive technology 
IVF—In vitro fertilization 
ICSI—Intracytoplasmic sperm injection 
hPSCs—Human pluripotent stem cells 
hESCs—Human embryonic stem cells 
ICM—Inner cell mass 
iPSCs—Induced pluripotent stem cells 
Genes 2021, 12, 1704  13  of  19  
 
ntESCs—Nuclear transfer embryonic stem cells 
AS—Angelman syndrome 
PWS—Prader–Willi syndrome 
LOI—Loss of imprinting 
lncRNA—Long non‐coding RNA 
BWS—Beckwith–Wiedemann syndrome 
DMR—Differentially methylated region 
SRS—Silver–Russell syndrome 
ICR—Imprinting coding region 
TET—Ten‐eleven translocation methylcytosine dioxygenases 
5mC—5‐Methylcytosine 
5hmC—5‐Hydroxymethylcytosine 
ZFP—Zinc finger protein 
DNMT—DNA methyltransferase 
KAP1—KRAB‐associated protein 1 
mESC—mouse embryonic stem cells 
LOM—Loss of methylation 
GOM—Gain of methylation 
SNP—Single nucleotide polymorphism 
ID—Imprinting disorder 
References 
1. Ferguson‐Smith, A.C. Genomic  imprinting:  The  emergence  of  an  epigenetic  paradigm. Nat. Rev. Genet.  2011,  12,  565–575. 
https://doi.org/10.1038/nrg3032. 
2. Bartolomei, M.S.;  Ferguson‐Smith, A. Mammalian Genomic  Imprinting.  Cold  Spring Harb.  Perspect.  Biol.  2011,  3,  a002592. 
https://doi.org/10.1101/cshperspect.a002592. 
3. Tucci, V.; Isles, A.; Kelsey, G.; Ferguson‐Smith, A.C.; The Erice Imprinting Group. Genomic Imprinting and Physiological Pro‐
cesses in Mammals. Cell 2019, 176, 952–965. https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.01.043. 
4. Davies, J.R.; Dent, C.L.; McNamara, I.G.; Isles, A.R. Behavioural effects of imprinted genes. Curr. Opin. Behav. Sci. 2015, 2, 28–
33. https://doi.org/10.1016/j.cobeha.2014.07.008. 
5. Wilkinson, L.S.; Davies, W.; Isles, A.R. Genomic imprinting effects on brain development and function. Nat. Rev. Neurosci. 2007, 
8, 832–843. https://doi.org/10.1038/nrn2235. 
6. Soellner, L.; Begemann, M.; Mackay, D.J.; Grønskov, K.; Tümer, Z.; Maher, E.R.; Temple, I.K.; Monk, D.; Riccio, A.; Linglart, A.; 
et al. Recent Advances in Imprinting Disorders. Clin. Genet. 2016, 91, 3–13. https://doi.org/10.1111/cge.12827. 
7. Henningsen, A.A.; Gissler, M.; Rasmussen, S.; Opdahl, S.; Wennerholm, U.B.; Spangmose, A.L.; Tiitinen, A.; Bergh, C.; Romund‐
stad, L.B.; Laivuori, H.; et al. Imprinting disorders  in children born after ART: A Nordic study from the CoNARTaS group. 
Hum. Reprod. 2020, 35, 1178–1184. https://doi.org/10.1093/humrep/deaa039. 
8. Eroglu, A.; Layman, L.C. Role of ART in Imprinting Disorders. Semin. Reprod. Med. 2012, 30, 92–104. https://doi.org/10.1055/s‐
0032‐1307417. 
Genes 2021, 12, 1704  14  of  19  
 
9. Manipalviratn, S.; DeCherney, A.; Segars, J. Imprinting disorders and assisted reproductive technology. Fertil. Steril. 2009, 91, 
305–315. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2009.01.002. 
10. Odom, L.N.; Segars, J. Imprinting disorders and assisted reproductive technology. Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 2010, 
17, 517–522. https://doi.org/10.1097/med.0b013e32834040a3. 
11. Cortessis, V.; Azadian, M.; Buxbaum, J.; Sanogo, F.; Song, A.Y.; Sriprasert, I.; Wei, P.C.; Yu, J.; Chung, K.; Siegmund, K.D. Com‐
prehensive meta‐analysis reveals association between multiple imprinting disorders and conception by assisted reproductive 
technology. J. Assist. Reprod. Genet. 2018, 35, 943–952. https://doi.org/10.1007/s10815‐018‐1173‐x. 
12. Amor, D.J.; Halliday, J. A review of known imprinting syndromes and their association with assisted reproduction technologies. 
Hum. Reprod. 2008, 23, 2826–2834. https://doi.org/10.1093/humrep/den310. 
13. Brioude, F.; Kalish, J.M.; Mussa, A.; Foster, A.C.; Bliek, J.; Ferrero, G.B.; Boonen, S.E.; Cole, T.; Baker, R.; Bertoletti, M.; et al. 
Expert consensus document: Clinical and molecular diagnosis, screening and management of Beckwith–Wiedemann syndrome: 
An international consensus statement. Nat. Rev. Endocrinol. 2018, 14, 229–249. https://doi.org/10.1038/nrendo.2017.166. 
14. Choufani, S.; Shuman, C.; Weksberg, R. Beckwith‐Wiedemann syndrome. Am. J. Med. Genet. Part C Semin. Med. Genet. 2010, 
154C, 343–354. https://doi.org/10.1002/ajmg.c.30267. 
15. De Angelis, A.M.; Martini, A.E.; Owen, C.M. Assisted Reproductive Technology and Epigenetics. Semin. Reprod. Med. 2018, 36, 
221–232. https://doi.org/10.1055/s‐0038‐1675780. 
16. Mussa, A.; Molinatto, C.; Cerrato, F.; Palumbo, O.; Carella, M.; Baldassarre, G.; Carli, D.; Peris, C.; Riccio, A.; Ferrero, G.B. 
Assisted  Reproductive  Techniques  and  Risk  of  Beckwith‐Wiedemann  Syndrome.  Pediatrics  2017,  140,  e20164311. 
https://doi.org/10.1542/peds.2016‐4311. 
17. Lidegaard, Ø.; Pinborg, A.; Andersen, A.N. Imprinting diseases and IVF: Danish National IVF cohort study. Hum. Reprod. 2005, 
20, 950–954. https://doi.org/10.1093/humrep/deh714. 
18. Tenorio, J.; Romanelli, V.; Martin‐Trujillo, A.; Fernández, G.‐M.; Segovia, M.; Perandones, C.; Jurado, L.A.P.; Esteller, M.; Fraga, 
M.; Arias, P.; et al. Clinical and molecular analyses of Beckwith‐Wiedemann syndrome: Comparison between spontaneous 
conception  and  assisted  reproduction  techniques.  Am.  J.  Med.  Genet.  Part  A  2016,  170,  2740–2749. 
https://doi.org/10.1002/ajmg.a.37852. 
19. Johnson, J.P.; Beischel, L.; Schwanke, C.; Styren, K.; Crunk, A.; Schoof, J.; Elias, A.F. Overrepresentation of pregnancies con‐
ceived by artificial  reproductive  technology  in prenatally  identified  fetuses with Beckwith‐Wiedemann syndrome.  J. Assist. 
Reprod. Genet. 2018, 35, 985–992. https://doi.org/10.1007/s10815‐018‐1228‐z. 
20. Wakeling, E.L.; Abu Amero, S.; Alders, M.; Bliek, J.; Forsythe, E.; Kumar, S.; Lim, D.; Macdonald, F.; Mackay, D.J.; Maher, E.R.; 
et  al.  Epigenotype‐phenotype  correlations  in  Silver‐Russell  syndrome.  J.  Med.  Genet.  2010,  47,  760–768. 
https://doi.org/10.1136/jmg.2010.079111. 
21. Wakeling, E.L.; Brioude, F.; Lokulo‐Sodipe, K.; O’Connell, S.M.; Salem, J.; Bliek, J.; Canton, A.P.M.; Chrzanowska, K.; Davies, 
J.; Dias, R.P.; et al. Diagnosis and management of Silver–Russell syndrome: First international consensus statement. Nat. Rev. 
Endocrinol. 2017, 13, 105–124. https://doi.org/10.1038/nrendo.2016.138. 
22. Abu‐Amero, S.; Monk, D.; Frost, J.; Preece, M.; Stanier, P.; Moore, E.G. The genetic aetiology of Silver‐Russell syndrome. J. Med 
Genet. 2007, 45, 193–199. https://doi.org/10.1136/jmg.2007.053017. 
23. Hiura, H.; Okae, H.; Miyauchi, N.; Sato, F.; Sato, A.; Van De Pette, M.; John, R.M.; Kagami, M.; Nakai, K.; Soejima, H.; et al. 
Characterization of DNA methylation errors in patients with imprinting disorders conceived by assisted reproduction technol‐
ogies. Hum. Reprod. 2012, 27, 2541–2548. https://doi.org/10.1093/humrep/des197. 
24. Hattori, H.; Hiura, H.; Kitamura, A.; Miyauchi, N.; Kobayashi, N.; Takahashi, S.; Okae, H.; Kyono, K.; Kagami, M.; Ogata, T.; et 
al. Association of four imprinting disorders and ART. Clin. Epigenetics 2019, 11, 1–12. https://doi.org/10.1186/s13148‐019‐0623‐3. 
25. Cassidy,  S.B.;  Schwartz,  S.;  Miller,  J.L.;  Driscoll,  D.J.  Prader‐Willi  syndrome.  Genet.  Med.  2011,  14,  10–26. 
https://doi.org/10.1038/gim.0b013e31822bead0. 
26. Gold, J.‐A.; Ruth, C.; Osann, K.; Flodman, P.; McManus, B.; Lee, H.‐S.; Donkervoort, S.; Khare, M.; Ma, E.R.; Dykens, E.; et al. 
Frequency of Prader–Willi syndrome in births conceived via assisted reproductive technology. Genet. Med. 2014, 16, 164–169. 
https://doi.org/10.1038/gim.2013.97. 
27. Hiura, H.; Okae, H.; Chiba, H.; Miyauchi, N.; Sato, F.; Sato, A.; Arima, T. Imprinting methylation errors in ART. Reprod. Med. 
Biol. 2014, 13, 193–202. https://doi.org/10.1007/s12522‐014‐0183‐3. 
28. Matsubara, K.; Murakami, N.; Nagai, T.; Ogata, T. Maternal age effect on the development of Prader–Willi syndrome resulting 
from upd(15)mat through meiosis 1 errors. J. Hum. Genet. 2011, 56, 566–571. https://doi.org/10.1038/jhg.2011.59. 
29. Williams, A.C.; Driscoll, D.J.; Dagli, I.A. Clinical and genetic aspects of Angelman syndrome. Genet. Med. 2010, 12, 385–395. 
https://doi.org/10.1097/gim.0b013e3181def138. 
30. Sutcliffe, A.; Peters, C.; Bowdin, S.; Temple, I.K.; Reardon, W.; Wilson, L.; Clayton‐Smith, J.; Brueton, L.; Bannister, W.; Maher, 
E. Assisted reproductive therapies and imprinting disorders—a preliminary British survey. Hum. Reprod. 2006, 21, 1009–1011. 
https://doi.org/10.1093/humrep/dei405. 
31. Chi, F.; Zhao, M.; Li, K.; Lin, A.‐Q.; Li, Y.; Teng, X. DNA methylation status of imprinted H19 and KvDMR1 genes in human 
placentas after conception using assisted reproductive technology. Ann. Transl. Med. 2020, 8, 854. https://doi.org/10.21037/atm‐
20‐3364. 
Genes 2021, 12, 1704  15  of  19  
 
32. Lazaraviciute, G.; Kauser, M.; Bhattacharya, S.; Haggarty, P.; Bhattacharya, S. A systematic review and meta‐analysis of DNA 
methylation levels and imprinting disorders in children conceived by IVF/ICSI compared with children conceived spontane‐
ously. Hum. Reprod. Updat. 2014, 20, 840–852. https://doi.org/10.1093/humupd/dmu033. 
33. Edwards, C.A.; Ferguson‐Smith, A.C. Mechanisms regulating imprinted genes in clusters. Curr. Opin. Cell Biol. 2007, 19, 281–
289. https://doi.org/10.1016/j.ceb.2007.04.013. 
34. Chang, S.; Bartolomei, M.S. Modeling human epigenetic disorders in mice: Beckwith‐Wiedemann Syndrome and Silver‐Russell 
Syndrome. Dis. Model. Mech. 2020, 13. https://doi.org/10.1242/dmm.044123. 
35. Cleaton, M.A.; Edwards, C.A.; Ferguson‐Smith, A.C. Phenotypic Outcomes of Imprinted Gene Models in Mice: Elucidation of 
Pre‐ and Postnatal Functions of Imprinted Genes. Annu. Rev. Genom. Hum. Genet. 2014, 15, 93–126. https://doi.org/10.1146/an‐
nurev‐genom‐091212‐153441. 
36. John,  R.M.  Engineering  mouse  models  to  investigate  the  function  of  imprinting.  Brief.  Funct.  Genom.  2010,  9,  294–303. 
https://doi.org/10.1093/bfgp/elq010. 
37. Tunster, S.; Van de Pette, M.; John, R. Fetal overgrowth in the Cdkn1c mouse model of Beckwith‐Wiedemann syndrome. Dis. 
Model. Mech. 2011, 4, 814–821. https://doi.org/10.1242/dmm.007328. 
38. McNamara, G.I.; Davis, B.A.; Dwyer, D.; John, R.; Isles, A.R. Behavioural abnormalities in a novel mouse model for Silver Rus‐
sell Syndrome. Hum. Mol. Genet. 2016, 25, 5407–5417. https://doi.org/10.1093/hmg/ddw357. 
39. Lewis, M.; Franco, D.V.; Morse, A.D.; Resnick, J.L. A mouse model of Angelman syndrome imprinting defects. Hum. Mol. Genet. 
2018, 28, 220–229. https://doi.org/10.1093/hmg/ddy345. 
40. Horii, T.; Morita, S.; Hino, S.; Kimura, M.; Hino, Y.; Kogo, H.; Nakao, M.; Hatada, I. Successful generation of epigenetic disease 
model mice by targeted demethylation of the epigenome. Genome Biol. 2020, 21, 77–17. https://doi.org/10.1186/s13059‐020‐01991‐
8. 
41. Prasasya, R.; Grotheer, K.V.; Siracusa, L.D.; Bartolomei, M.S. Temple syndrome and Kagami‐Ogata syndrome: Clinical presen‐
tations, genotypes, models and mechanisms. Hum. Mol. Genet. 2020, 29, R107–R116. https://doi.org/10.1093/hmg/ddaa133. 
42. Yu, B.; Smith, T.H.; Battle, S.L.; Ferrell, S.; Hawkins, R.D. Superovulation alters global DNA methylation in early mouse embryo 
development. Epigenetics 2019, 14, 780–790. https://doi.org/10.1080/15592294.2019.1615353. 
43. Sato, A.; Otsu, E.; Negishi, H.; Utsunomiya, T.; Arima, T. Aberrant DNA methylation of imprinted loci in superovulated oocytes. 
Hum. Reprod. 2007, 22, 26–35. https://doi.org/10.1093/humrep/del316. 
44. Market‐Velker, B.A.; Zhang, L.; Magri, L.S.; Bonvissuto, A.C.; Mann, M.R. Dual effects of superovulation: Loss of maternal and 
paternal  imprinted  methylation  in  a  dose‐dependent  manner.  Hum.  Mol.  Genet.  2010,  19,  36–51. 
https://doi.org/10.1093/hmg/ddp465. 
45. Chen, X.; Huang, Y.; Huang, H.; Guan, Y.; Li, M.; Jiang, X.; Yu, M.; Yang, X. Effects of superovulation, in vitro fertilization, and 
oocyte  in  vitro  maturation  on  imprinted  gene  Grb10  in  mouse  blastocysts.  Arch.  Gynecol.  Obstet.  2018,  298,  1219–1227. 
https://doi.org/10.1007/s00404‐018‐4905‐3. 
46. Fortier, A.L.; Lopes, F.L.; Darricarrère, N.; Martel, J.; Trasler, J.M. Superovulation alters the expression of imprinted genes in 
the midgestation mouse placenta. Hum. Mol. Genet. 2008, 17, 1653–1665. https://doi.org/10.1093/hmg/ddn055. 
47. Jahanbakhsh‐Asl, E.; Salehi, M.; Ghaffari‐Novin, M.; Kato, Y. Superovulation Affects  the Gene Expression Patterns of Mice 
Oocytes and Preimplantation Embryos Produced by Different Assisted Reproductive Technologies. Int. J. Women’s Health Re‐
prod. Sci. 2018, 6, 444–451. https://doi.org/10.15296/ijwhr.2018.74. 
48. Velker, B.A.M.; Denomme, M.M.; Krafty, R.T.; Mann, M.R.W. Maintenance of Mest imprinted methylation in blastocyst‐stage 
mouse embryos is less stable than other imprinted loci following superovulation or embryo culture. Environ. Epigenetics 2017, 
3, dvx015. https://doi.org/10.1093/eep/dvx015. 
49. Sato, C.; Shimada, M.; Mori, T.; Kumasako, Y.; Otsu, E.; Watanabe, H.; Utsunomiya, T. Assessment of human oocyte develop‐
mental  competence  by  cumulus  cell morphology  and  circulating  hormone  profile. Reprod. Biomed. Online  2007,  14,  49–56. 
https://doi.org/10.1016/s1472‐6483(10)60763‐8. 
50. Khoureiry, R.; Ibala‐Rhomdane, S.; Mery, L.; Blachere, T.; Guerin, J.‐F.; Lornage, J.; Lefevre, A. Dynamic CpG methylation of 
the  KCNQ1OT1  gene  during  maturation  of  human  oocytes.  J.  Med.  Genet.  2008,  45,  583–588. 
https://doi.org/10.1136/jmg.2008.057943. 
51. Geuns, E.; Hilven, P.; Van Steirteghem, A.; Liebaers, I.; De Rycke, M. Methylation analysis of KvDMR1 in human oocytes. J. 
Med. Genet. 2006, 44, 144–147. https://doi.org/10.1136/jmg.2006.044149. 
52. Takahashi, N.; Coluccio, A.; Thorball, C.W.; Planet, E.; Shi, H.; Offner, S.; Turelli, P.; Imbeault, M.; Ferguson‐Smith, A.C.; Trono, 
D. ZNF445 is a primary regulator of genomic imprinting. Genes Dev. 2019, 33, 49–54. https://doi.org/10.1101/gad.320069.118. 
53. Okae, H.; Chiba, H.; Hiura, H.; Hamada, H.; Sato, A.; Utsunomiya, T.; Kikuchi, H.; Yoshida, H.; Tanaka, A.; Suyama, M.; et al. 
Genome‐Wide Analysis of DNA Methylation Dynamics during Early Human Development. PLoS Genet. 2014, 10, e1004868. 
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004868. 
54. Ma, Y.; Ma, Y.; Wen, L.; Lei, H.; Chen, S.; Wang, X. Changes in DNA methylation and imprinting disorders in E9.5 mouse fetuses 
and placentas derived from vitrified eight‐cell embryos. Mol. Reprod. Dev. 2019, 86, 404–415. https://doi.org/10.1002/mrd.23118. 
55. Li, T.; Vu, T.H.; Ulaner, G.A.; Littman, E.; Ling, J.‐Q.; Chen, H.‐L.; Hu, J.‐F.; Behr, B.; Giudice, L.; Hoffman, A.R. IVF results in 
de novo DNA methylation and histone methylation at an Igf2‐H19 imprinting epigenetic switch. Mol. Hum. Reprod. 2005, 11, 
631–640. https://doi.org/10.1093/molehr/gah230. 
Genes 2021, 12, 1704  16  of  19  
 
56. Market‐Velker, B.; Fernandes, A.; Mann, M. Side‐by‐Side Comparison of Five Commercial Media Systems in a Mouse Model: 
Suboptimal In Vitro Culture Interferes with Imprint Maintenance1. Biol. Reprod. 2010, 83, 938–950. https://doi.org/10.1095/bi‐
olreprod.110.085480. 
57. Denomme, M.M.; Mann, M.R.W. Genomic imprints as a model for the analysis of epigenetic stability during assisted reproduc‐
tive technologies. Reproduction 2012, 144, 393–409. https://doi.org/10.1530/rep‐12‐0237. 
58. Mani,  S.;  Mainigi,  M.  Embryo  Culture  Conditions  and  the  Epigenome.  Semin.  Reprod.  Med.  2018,  36,  211–220. 
https://doi.org/10.1055/s‐0038‐1675777. 
59. Velker, B.A.M.; Denomme, M.M.; Mann, M.R.W. Embryo Culture and Epigenetics. In Advanced Structural Safety Studies; Hu‐
mana Press: Methods Mol Biol. 2012; Volume 912, pp. 399–421. 
60. Kindsfather, A.J.; Czekalski, M.A.; Pressimone, C.A.; Erisman, M.P.; Mann, M.R.W. Perturbations  in  imprinted methylation 
from assisted reproductive technologies but not advanced maternal age in mouse preimplantation embryos. Clin. Epigenetics 
2019, 11, 162. https://doi.org/10.1186/s13148‐019‐0751‐9. 
61. Lopes, F.L.; Fortier, A.L.; Darricarrère, N.; Chan, D.; Arnold, D.R.; Trasler, J.M. Reproductive and epigenetic outcomes associ‐
ated with aging mouse oocytes. Hum. Mol. Genet. 2009, 18, 2032–2044. https://doi.org/10.1093/hmg/ddp127. 
62. Mann, M.R.W.; Lee, S.S.; Doherty, A.S.; Verona, R.I.; Nolen, L.D.; Schultz, R.M.; Bartolomei, M.S. Selective loss of imprinting in 
the  placenta  following  preimplantation  development  in  culture.  Development  2004,  131,  3727–3735. 
https://doi.org/10.1242/dev.01241. 
63. Doherty, A.S.; Mann, M.R.; Tremblay, K.D.; Bartolomei, M.S.; Schultz, R.M. Differential Effects of Culture on Imprinted H19 
Expression  in  the  Preimplantation  Mouse  Embryo1.  Biol.  Reprod.  2000,  62,  1526–1535.  https://doi.org/10.1095/biolre‐
prod62.6.1526. 
64. Chen, S.; Zhang, M.; Li, L.; Wang, M.; Shi, Y.; Zhang, H.; Kang, B.; Tang, N.; Li, B. Loss of methylation of H19‐imprinted gene 
derived from assisted reproductive technologies can be mitigated by cleavage‐stage embryo transfer in mice. J. Assist. Reprod. 
Genet. 2019, 36, 2259–2269. https://doi.org/10.1007/s10815‐019‐01575‐x. 
65. Fauque, P.; Jouannet, P.; Lesaffre, C.; Ripoche, M.‐A.; Dandolo, L.; Vaiman, D.; Jammes, H. Assisted Reproductive Technology 
affects developmental kinetics, H19 Imprinting Control Region methylation and H19 gene expression in individual mouse em‐
bryos. BMC Dev. Biol. 2007, 7, 116. https://doi.org/10.1186/1471‐213x‐7‐116. 
66. Yao, J.; Geng, L.; Huang, R.; Peng, W.; Chen, X.; Jiang, X.; Xiaoyu, Y.; Lixia, G.; Huang, Y.; Yang, X. Effect of vitrification on in 
vitro development and imprinted gene Grb10 in mouse embryos. Reproduction 2017, 154, 197–205. https://doi.org/10.1530/rep‐
16‐0480. 
67. De Waal, E.; Yamazaki, Y.; Ingale, P.; Bartolomei, M.; Yanagimachi, R.; McCarrey, J.R. Primary epimutations introduced during 
intracytoplasmic sperm injection (ICSI) are corrected by germline‐specific epigenetic reprogramming. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 
2012, 109, 4163–4168. https://doi.org/10.1073/pnas.1201990109. 
68. Saenz‐De‐Juano, M.; Billooye, K.; Smitz, J.; Anckaert, E. The loss of imprinted DNA methylation in mouse blastocysts is inflicted 
to  a  similar  extent  byin  vitrofollicle  culture  and  ovulation  induction.  Mol.  Hum.  Reprod.  2016,  22,  427–441. 
https://doi.org/10.1093/molehr/gaw013. 
69. Rentsendorj, A.; Mohan, S.; Szabó, P.; Mann, J.R. A Genomic Imprinting Defect in Mice Traced to a Single Gene. Genetics 2010, 
186, 917–927. https://doi.org/10.1534/genetics.110.118802. 
70. Ferguson‐Smith, A.; Cattanach, B.M.; Barton, S.C.; Beechey, C.V.; Surani, M.A. Embryological and molecular investigations of 
parental imprinting on mouse chromosome 7. Nat. Cell Biol. 1991, 351, 667–670. https://doi.org/10.1038/351667a0. 
71. Liu, W.; Deng, Y.; Liu, Y.; Gong, W.; Deng, W. Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies. J. Biochem. Mol. 
Toxicol. 2013, 27, 17–27. https://doi.org/10.1002/jbt.21470. 
72. Ben‐David, U.; Kopper, O.; Benvenisty, N. Expanding the Boundaries of Embryonic Stem Cells. Cell Stem Cell 2012, 10, 666–677. 
https://doi.org/10.1016/j.stem.2012.05.003. 
73. Rowe, R.G.; Daley, G.Q. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat. Rev. Genet. 2019, 20, 377–
388. https://doi.org/10.1038/s41576‐019‐0100‐z. 
74. Doss, M.X.; Sachinidis, A. Current Challenges of iPSC‐Based Disease Modeling and Therapeutic Implications. Cells 2019, 8, 403. 
https://doi.org/10.3390/cells8050403. 
75. Takahashi, K.; Yamanaka, S.  Induction of Pluripotent Stem Cells  from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by 
Defined Factors. Cell 2006, 126, 663–676. https://doi.org/10.1016/j.cell.2006.07.024. 
76. Wernig, M.; Meissner, A.; Foreman, R.; Brambrink, T.; Ku, M.; Hochedlinger, K.; Bernstein, B.E.; Jaenisch, R. In vitro reprogram‐
ming of fibroblasts into a pluripotent ES‐cell‐like state. Nat. Cell Biol. 2007, 448, 318–324. https://doi.org/10.1038/nature05944. 
77. Mikkelsen, T.S.; Hanna, J.; Zhang, X.; Ku, M.; Wernig, M.; Schorderet, P.; Bernstein, B.E.; Jaenisch, R.; Lander, E.S.; Meissner, A. 
Dissecting  direct  reprogramming  through  integrative  genomic  analysis.  Nat.  Cell  Biol.  2008,  454,  49–55. 
https://doi.org/10.1038/nature07056. 
78. Guenther, M.G.; Frampton, G.; Soldner, F.; Hockemeyer, D.; Mitalipova, M.; Jaenisch, R.; Young, R.A. Chromatin Structure and 
Gene  Expression  Programs  of  Human  Embryonic  and  Induced  Pluripotent  Stem  Cells.  Cell  Stem  Cell  2010,  7,  249–257. 
https://doi.org/10.1016/j.stem.2010.06.015. 
79. Martins‐Taylor, K.; Hsiao,  J.S.; Chen, P.‐F.; Glatt‐Deeley, H.; De Smith, A.J.; Blakemore, A.I.; Lalande, M.; Chamberlain, S.J. 
Imprinted expression of UBE3A in non‐neuronal cells from a Prader–Willi syndrome patient with an atypical deletion. Hum. 
Mol. Genet. 2014, 23, 2364–2373. https://doi.org/10.1093/hmg/ddt628. 
Genes 2021, 12, 1704  17  of  19  
 
80. Yang, J.; Cai, J.; Zhang, Y.; Wang, X.; Li, W.; Xu, J.; Li, F.; Guo, X.; Deng, K.; Zhong, M.; et al. Induced Pluripotent Stem Cells 
Can  Be  Used  to  Model  the  Genomic  Imprinting  Disorder  Prader‐Willi  Syndrome.  J.  Biol.  Chem.  2010,  285,  40303–40311. 
https://doi.org/10.1074/jbc.m110.183392. 
81. Fink, J.J.; Robinson, T.M.; Germain, N.D.; Sirois, C.; Bolduc, K.A.; Ward, A.J.; Rigo, F.; Chamberlain, S.J.; Levine, E.S. Disrupted 
neuronal  maturation  in  Angelman  syndrome‐derived  induced  pluripotent  stem  cells.  Nat.  Commun.  2017,  8,  15038. 
https://doi.org/10.1038/ncomms15038. 
82. Chamberlain, S.J.; Chen, P.‐F.; Ng, K.Y.; Bourgois‐Rocha, F.; Lemtiri‐Chlieh, F.; Levine, E.; Lalande, M. Induced pluripotent 
stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader–Willi syndromes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2010, 
107, 17668–17673. https://doi.org/10.1073/pnas.1004487107. 
83. Stanurova, J.; Neureiter, A.; Hiber, M.; Kessler, H.D.O.; Stolp, K.; Goetzke, R.; Klein, D.; Bankfalvi, A.; Klump, H.; Steenpass, L. 
Angelman  syndrome‐derived  neurons  display  late  onset  of  paternal  UBE3A  silencing.  Sci.  Rep.  2016,  6,  30792. 
https://doi.org/10.1038/srep30792. 
84. Nazor, K.L.; Altun, G.; Lynch, C.; Tran, H.; Harness, J.V.; Slavin, I.; Garitaonandia, I.; Müller, F.‐J.; Wang, Y.‐C.; Boscolo, F.S.; et 
al. Recurrent Variations in DNA Methylation in Human Pluripotent Stem Cells and Their Differentiated Derivatives. Cell Stem 
Cell 2012, 10, 620–634. https://doi.org/10.1016/j.stem.2012.02.013. 
85. Okuno, H.; Nakabayashi, K.; Abe, K.; Ando, T.; Sanosaka, T.; Kohyama, J.; Akamatsu, W.; Ohyama, M.; Takahashi, T.; Kosaki, 
K.; et al. Changeability of the fully methylated status of the 15q11.2 region in induced pluripotent stem cells derived from a 
patient with Prader‐Willi syndrome. Congenit. Anom. 2017, 57, 96–103. https://doi.org/10.1111/cga.12206. 
86. Chang, S.; Hur, S.K.; Naveh, N.S.S.; Thorvaldsen, J.L.; French, D.L.; Gagne, A.L.; Jobaliya, C.D.; Anguera, M.C.; Bartolomei, 
M.S.; Kalish, J.M. Derivation and investigation of the first human cell‐based model of Beckwith‐Wiedemann syndrome. Epige‐
netics 2020, https://doi.org/10.1080/15592294.2020.1861172. 
87. Hill, P.; Amouroux, R.; Hajkova, P. DNA demethylation, Tet proteins and 5‐hydroxymethylcytosine in epigenetic reprogram‐
ming: An emerging complex story. Genomics 2014, 104, 324–333. https://doi.org/10.1016/j.ygeno.2014.08.012. 
88. Perrera, V.; Martello, G. How Does Reprogramming to Pluripotency Affect Genomic Imprinting? Front. Cell Dev. Biol. 2019, 7, 
76. https://doi.org/10.3389/fcell.2019.00076. 
89. Godini, R.; Lafta, H.Y.; Fallahi, H. Epigenetic modifications in the embryonic and induced pluripotent stem cells. Gene Expr. 
Patterns 2018, 29, 1–9. https://doi.org/10.1016/j.gep.2018.04.001. 
90. Li, X.; Li, M.J.; Yang, Y.; Bai, Y. Effects of reprogramming on genomic imprinting and the application of pluripotent stem cells. 
Stem Cell Res. 2019, 41, 101655. https://doi.org/10.1016/j.scr.2019.101655. 
91. Johannesson, B.; Sagi, I.; Gore, A.; Paull, D.; Yamada, M.; Golan‐Lev, T.; Li, Z.; Le Duc, C.; Shen, Y.; Stern, S.; et al. Comparable 
Frequencies of Coding Mutations and Loss of Imprinting in Human Pluripotent Cells Derived by Nuclear Transfer and Defined 
Factors. Cell Stem Cell 2014, 15, 634–642. https://doi.org/10.1016/j.stem.2014.10.002. 
92. Bar, S.; Schachter, M.; Eldar‐Geva, T.; Benvenisty, N. Large‐Scale Analysis of Loss of Imprinting in Human Pluripotent Stem 
Cells. Cell Rep. 2017, 19, 957–968. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.04.020. 
93. Ma, H.; Morey, R.; O’Neil, R.C.; He, Y.; Daughtry, B.; Schultz, M.D.; Hariharan, M.; Nery, J.R.; Castanon, R.; Sabatini, K.; et al. 
Abnormalities  in  human  pluripotent  cells  due  to  reprogramming  mechanisms.  Nat.  Cell  Biol.  2014,  511,  177–183. 
https://doi.org/10.1038/nature13551. 
94. Ruiz, S.; Diep, D.; Gore, A.; Panopoulos, A.; Montserrat, N.; Plongthongkum, N.; Kumar, S.; Fung, H.‐L.; Giorgetti, A.; Bilic, J.; 
et al. Identification of a specific reprogramming‐associated epigenetic signature in human induced pluripotent stem cells. Proc. 
Natl. Acad. Sci. USA 2012, 109, 16196–16201. https://doi.org/10.1073/pnas.1202352109. 
95. Wen, W.; Zhang, J.‐P.; Xu, J.; Su, R.J.; Neises, A.; Ji, G.‐Z.; Yuan, W.; Cheng, T.; Zhang, X.‐B. Enhanced Generation of Integration‐
free iPSCs from Human Adult Peripheral Blood Mononuclear Cells with an Optimal Combination of Episomal Vectors. Stem 
Cell Rep. 2016, 6, 873–884. https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2016.04.005. 
96. Lister, R.; Pelizzola, M.; Kida, Y.; Hawkins, R.D.; Nery, J.R.; Hon, G.; Antosiewicz‐Bourget, J.; O’Malley, R.; Castanon, R.; Klug‐
man, S.; et al. Hotspots of aberrant epigenomic reprogramming in human induced pluripotent stem cells. Nat. Cell Biol. 2011, 
471, 68–73. https://doi.org/10.1038/nature09798. 
97. Bar‐Nur, O.; Russ, H.A.; Efrat, S.; Benvenisty, N. Epigenetic Memory and Preferential Lineage‐Specific Differentiation in In‐
duced  Pluripotent  Stem  Cells  Derived  from  Human  Pancreatic  Islet  Beta  Cells.  Cell  Stem  Cell  2011,  9,  17–23. 
https://doi.org/10.1016/j.stem.2011.06.007. 
98. Bar,  S.;  Benvenisty,  N.  Epigenetic  aberrations  in  human  pluripotent  stem  cells.  EMBO  J.  2019,  38,  e101033. 
https://doi.org/10.15252/embj.2018101033. 
99. Rouhani, F.; Kumasaka, N.; De Brito, M.C.; Bradley, A.; Vallier, L.; Gaffney, D. Genetic Background Drives Transcriptional 
Variation  in  Human  Induced  Pluripotent  Stem  Cells.  PLoS  Genet.  2014,  10,  e1004432.  https://doi.org/10.1371/jour‐
nal.pgen.1004432. 
100. Vaskova, E.A.; Stekleneva, A.E.; Medvedev, S.P.; Zakian, S.M. “Epigenetic Memory” Phenomenon in Induced Pluripotent Stem 
Cells. Acta Nat. 2013, 5, 15–21. https://doi.org/10.32607/20758251‐2013‐5‐4‐15‐21. 
101. Sun, D.; Yi, S.V. Impacts of Chromatin States and Long‐Range Genomic Segments on Aging and DNA Methylation. PLoS ONE 
2015, 10, e0128517. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0128517. 
102. Jones,  M.J.;  Goodman,  S.J.;  Kobor,  M.  DNA  methylation  and  healthy  human  aging.  Aging  Cell  2015,  14,  924–932. 
https://doi.org/10.1111/acel.12349. 
Genes 2021, 12, 1704  18  of  19  
 
103. Shan, Z.‐Y.; Wu, Y.‐S.; Li, X.; Shen, X.‐H.; Wang, Z.‐D.; Liu, Z.; Shen, J.‐L.; Lei, L. Continuous Passages Accelerate the Repro‐
gramming of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. Reprogramming 2014, 16, 77–83. https://doi.org/10.1089/cell.2013.0067. 
104. Nishino, K.; Umezawa, A. DNA methylation dynamics in human induced pluripotent stem cells. Hum. Cell 2016, 29, 97–100. 
https://doi.org/10.1007/s13577‐016‐0139‐5. 
105. Tesarova, L.; Simara, P.; Stejskal, S.; Koutna, I. The Aberrant DNA Methylation Profile of Human Induced Pluripotent Stem 
Cells Is Connected to the Reprogramming Process and Is Normalized During In Vitro Culture. PLoS ONE 2016, 11, e0157974. 
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0157974. 
106. Tchieu, J.; Kuoy, E.; Chin, M.H.; Trinh, H.; Patterson, M.; Sherman, S.; Aimiuwu, O.; Lindgren, A.; Hakimian, S.; Zack, J.A.; et 
al.  Female  Human  iPSCs  Retain  an  Inactive  X  Chromosome.  Cell  Stem  Cell  2010,  7,  329–342. 
https://doi.org/10.1016/j.stem.2010.06.024. 
107. Pick, M.; Stelzer, Y.; Bar‐Nur, O.; Mayshar, Y.; Eden, A.; Benvenisty, N. Clone‐ and Gene‐Specific Aberrations of Parental Im‐
printing in Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells 2009, 27, 2686–2690. https://doi.org/10.1002/stem.205. 
108. Takikawa, S.; Ray, C.; Wang, X.; Shamis, Y.; Wu, T.‐Y.; Li, X. Genomic imprinting is variably lost during reprogramming of 
mouse iPS cells. Stem Cell Res. 2013, 11, 861–873. https://doi.org/10.1016/j.scr.2013.05.011. 
109. Stadtfeld, M.; Apostolou, E.; Akutsu, H.; Fukuda, A.; Follett, P.; Natesan, S.; Kono, T.; Shioda, T.; Hochedlinger, K. Aberrant 
silencing of imprinted genes on chromosome 12qF1 in mouse induced pluripotent stem cells. Nat. Cell Biol. 2010, 465, 175–181. 
https://doi.org/10.1038/nature09017. 
110. Hiura, H.; Toyoda, M.; Okae, H.; Sakurai, M.; Miyauchi, N.; Sato, A.; Kiyokawa, N.; Okita, H.; Miyagawa, Y.; Akutsu, H.; et al. 
Stability of genomic imprinting in human induced pluripotent stem cells. BMC Genet. 2013, 14, 32. https://doi.org/10.1186/1471‐
2156‐14‐32. 
111. Rulands, S.; Lee, H.J.; Clark, S.J.; Angermueller, C.; Smallwood, S.A.; Krueger, F.; Mohammed, H.; Dean, W.; Nichols, J.; Rugg‐
Gunn, P.; et al. Genome‐Scale Oscillations  in DNA Methylation during Exit from Pluripotency. Cell Syst. 2018, 7, 63–76.e12. 
https://doi.org/10.1016/j.cels.2018.06.012. 
112. Yagi, M.; Kabata, M.; Ukai, T.; Ohta, S.; Tanaka, A.; Shimada, Y.; Sugimoto, M.; Araki, K.; Okita, K.; Woltjen, K.; et al. De Novo 
DNA Methylation at Imprinted Loci during Reprogramming into Naive and Primed Pluripotency. Stem Cell Rep. 2019, 12, 1113–
1128. https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2019.04.008. 
113. Shipony, Z.; Mukamel, Z.; Cohen, N.M.; Landan, G.; Chomsky, E.; Zeliger, S.R.; Fried, Y.C.; Ainbinder, E.; Friedman, N.; Tanay, 
A. Dynamic and static maintenance of epigenetic memory in pluripotent and somatic cells. Nat. Cell Biol. 2014, 513, 115–119. 
https://doi.org/10.1038/nature13458. 
114. Brix, J.; Zhou, Y.; Luo, Y. The Epigenetic Reprogramming Roadmap in Generation of iPSCs from Somatic Cells. J. Genet. Genom. 
2015, 42, 661–670. https://doi.org/10.1016/j.jgg.2015.10.001. 
115. Ishida,  M.;  Moore,  G.E.  The  role  of  imprinted  genes  in  humans.  Mol.  Asp.  Med.  2013,  34,  826–840. 
https://doi.org/10.1016/j.mam.2012.06.009. 
116. Hu, X.; Zhang, L.; Mao, S.‐Q.; Li, Z.; Chen, J.; Zhang, R.‐R.; Wu, H.‐P.; Gao, J.; Guo, F.; Liu, W.; et al. Tet and TDG Mediate DNA 
Demethylation Essential for Mesenchymal‐to‐Epithelial Transition in Somatic Cell Reprogramming. Cell Stem Cell 2014, 14, 512–
522. https://doi.org/10.1016/j.stem.2014.01.001. 
117. Bermejo‐Álvarez, P.; Ramos‐Ibeas, P.; Park, K.; Powell, A.P.; VanSandt, L.; Derek, B.; Ramirez, M.A.; Gutierrez‐Adan, A.; Tel‐
ugu, B.P. Tet‐mediated  imprinting erasure  in H19  locus  following reprogramming of spermatogonial stem cells  to  induced 
pluripotent stem cells. Sci. Rep. 2015, 5, 13691. https://doi.org/10.1038/srep13691. 
118. Duffié, R.; Ajjan, S.; Greenberg, M.; Zamudio, N.; Del Arenal, M.E.; Iranzo, J.; Okamoto, I.; Barbaux, S.; Fauque, P.; Bourc’His, 
D. The Gpr1/Zdbf2 locus provides new paradigms for transient and dynamic genomic imprinting in mammals. Genes Dev. 2014, 
28, 463–478. https://doi.org/10.1101/gad.232058.113. 
119. Kelsey, G.; Feil, R. New insights into establishment and maintenance of DNA methylation imprints in mammals. Philos. Trans. 
R. Soc. B Biol. Sci. 2013, 368, 20110336. https://doi.org/10.1098/rstb.2011.0336. 
120. Rugg‐Gunn, P.J.; Ferguson‐Smith, A.C.; Pedersen, R.A. Status of genomic imprinting in human embryonic stem cells as revealed 
by  a  large  cohort  of  independently  derived  and  maintained  lines.  Hum.  Mol.  Genet.  2007,  16,  R243–R251. 
https://doi.org/10.1093/hmg/ddm245. 
121. McDonald, C.M.; Liu, L.; Xiao, L.; Schaniel, C.; Li, X. Genomic imprinting defect in Zfp57 mutant iPS cell lines. Stem Cell Res. 
2016, 16, 259–263. https://doi.org/10.1016/j.scr.2016.01.018. 
122. Li, X.; Ito, M.; Zhou, F.; Youngson, N.; Zuo, X.; Leder, P.; Ferguson‐Smith, A.C. A Maternal‐Zygotic Effect Gene, Zfp57, Main‐
tains Both Maternal and Paternal Imprints. Dev. Cell 2008, 15, 547–557. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2008.08.014. 
123. Loh, Y.‐H.; Zhang, W.; Chen, X.; George, J.; Ng, H.H. Jmjd1a and Jmjd2c histone H3 Lys 9 demethylases regulate self‐renewal 
in embryonic stem cells. Genes Dev. 2007, 21, 2545–2557. https://doi.org/10.1101/gad.1588207. 
124. Voon, H.; Gibbons, R.J. Maintaining memory of silencing at imprinted differentially methylated regions. Cell. Mol. Life Sci. 2016, 
73, 1871–1879. https://doi.org/10.1007/s00018‐016‐2157‐6. 
 
 
 
Genes 2021, 12, 1704  19  of  19  
 
125. Barberet, J.; Binquet, C.; Guilleman, M.; Doukani, A.; Choux, C.; Bruno, C.; Bourredjem, A.; Chapusot, C.; Bourc’His, D.; Duf‐
fourd, Y.; et al. Do assisted reproductive technologies and in vitro embryo culture influence the epigenetic control of imprinted 
genes and transposable elements in children? Hum. Reprod. 2021, 36, 479–492. https://doi.org/10.1093/humrep/deaa310. 
126. Choux, C.; Binquet, C.; Carmignac, V.; Bruno, C.; Chapusot, C.; Barberet, J.; LaMotte, M.; Sagot, P.; Bourc’His, D.; Fauque, P. 
The epigenetic control of transposable elements and imprinted genes in newborns is affected by the mode of conception: ART 
versus  spontaneous conception without underlying  infertility. Hum. Reprod. 2017, 33, 331–340. https://doi.org/10.1093/hum‐
rep/dex366.